环境微生物监测培养基及培养条件的选择

环境微生物监测通常指洁净区环境沉降菌监测、浮游菌监测、表面微生物监测（包括设备设施及人员）。

行业内的指导文件或法规对监测用的培养基要求基本上是一致的，即：一般采用非选择性培养基——胰酪大豆胨琼脂培养基（Tryptone Soya agar  TSA，美国药典名称为soybean–casein digest medium/Soybean–Casein Digest Agar  缩写SCDM/SCDA），必要时可加入适宜的中和剂，当有疑似真菌生长时可使用沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）。但是对培养条件的要求则不尽统一，有着一定的区别，那我们该如何选择培养条件呢？

首先我们先看一下各国药典或行业标准对培养条件的要求。

中国：

GB/T 16293-2010 医药工业洁净室（区）浮游菌的测试方法

《中国药典》2020年版四部通则 9205 药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则

以上为GB/T 16293-2010和《中国药典》对环境监测微生物培养条件的要求，因GB/T 16293-2010相对较早，日常监测中可以主要遵循中国药典的规定进行培养。也就是TSA，30-35℃培养3-5天，当需要使用SDA时，20-25℃培养5-7天。

美国：

USP41-NF36 <1116>MICROBIOLOGICAL CONTROL AND MONITORING OF ASEPTIC PROCESSING ENVIRONMENTS （无菌加工环境的微生物控制和监测）  Official Date: Official Prior to 2013

【翻译】培养条件的选择

一旦选择了合适的培养基，就可以设置时间和培养温度。通常，对于SCDM等一般微生物生长培养基，使用约20°-35°的培养温度，培养时间不少于72小时。当已知污染物生长缓慢时，可以考虑较长的培养时间。上面给出的温度范围绝不是绝对的。典型设施环境中常见的嗜中温细菌和霉菌通常能够在较宽的温度范围内生长。对于许多中温性生物来说，可以在大约20°的范围内进行回收。在缺乏确凿证据的情况下，微生物学家可能会在较低和较高的温度下培养单个平板。首先在较低的温度下培养可能会影响革兰氏阳性球菌的恢复，这一点很重要，因为它们通常与人类有关。

FDA  Pharmaceutical Microbiology Manual（制药微生物手册）2020

【翻译】Hycheck载玻片和RODAC平板应立即在30-35oC下培养2天，然后在20oC-25oC下培养5天。当怀疑污染物生长缓慢时，可能需要更长的培养时间。每天检查平板是否有菌落形成，以最大限度地减少过度生长对较小菌落的遮挡。

以上为美国药典和FDA对环境监测微生物培养条件的规定，都遵循了如果采用双温度培养时应先进行高温培养再进行低温培养，即先在30-35℃下培养2天，再转至20-25℃下培养5天。

WHO：

Environmental Monitoring of Clean Rooms in Vaccine Manufacturing Facilities 世界卫生组织疫苗生产设施洁净室环境监测 2012

【翻译】3.3.9.环境样品的实验室测试

61.关注的微生物（例如，生产菌株；先前在EM期间鉴定的菌株；抗性或敏感菌株；或由当地流行条件预测的操作者的潜在感染）可能需要特殊的捕获和生长条件。

62.环境监测样品应在至少两个温度下培养，以检测细菌和真菌。在实践中，在20至25℃下培养3至5天，然后在30至35℃下再培养2-3天，已被证明足以检测大多数细菌和真菌。每个制造商选择的方法都应该经过仔细验证和标准化。当可以一致地证明关注的微生物的高回收率（>90%）时，替代方法是可以接受的。

WHO认为应先在20-25℃培养3-5天，再转至30-35℃培养2-3天。

其他组织相关要求：

ISO 14698-1：2003Cleanrooms and associated controlled environments — Biocontamination control —Part 1:General principles and methods 洁净室和相关控制环境.生物污染控制.第1部分：一般原理和方法

【翻译】5.5.3培养

在为接种的培养基选择合适的培养温度和时间时，应尽可能考虑有利于预期进入清洁环境的生物类型生长的条件。

细菌和真菌的总潜伏期分别为2至5天和5至7天，通常是可以接受的，尤其是当菌落单元（VU，viable unit）数量较低时。当厌氧、嗜热、微需氧或营养不足或挑剔的细菌和真菌受到关注时，可能需要特定的大气条件和培养时间。培养期间应每隔适当的时间观察培养皿。

BS EN 17141：2020 Cleanrooms and associated controlled environments — Biocontamination control 洁净室及其受控环境：生物污染控制

【翻译】E.4.5平板培养

培养条件可能因所列举的关注的微生物而异。

一般来说，在30℃至35℃下培养至少3天的总计数适合许多细菌的生长，在20℃至25℃下至少4天适合一些真菌的生长。培养时间和温度应合理。培养温度保持在20℃至35℃的范围内，目标温度在2.5℃以内。

PDA TR13 Fundamentals of an Environmental Monitoring Program-2022  环境监测程序基础

【翻译】7.5环境监测样本培育策略和验证

行业内的指导文件和实践在培养条件方面有所不同。关于选择合适的微生物生长培养基的信息是可用的，但关于合适的培养时间和最佳温度条件的信息是有限的，有时是相互矛盾的。

通常，总需氧菌数可以通过在30–35°C下培养48–72小时来获得。总的酵母和霉菌总数通常可以通过在20-25°C下孵育5-7天来获得。当已知污染物生长缓慢时，可以考虑较长的培养时间。行业调查显示，大多数公司使用两种温度的培养箱，先用较低的温度。

如果有科学依据并经过验证，可以采用多种培养方案，以提供适当的灵敏度。这些通常是基于实验室的体外研究，使用培养的微生物、参考培养物（如ATCC菌株）和从生产环境中回收的内部分离物的组合。Gordon等人发表的研究表明，体外测试和原位测试之间可能存在差异（37）。

PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology  PDA药物科学与技术杂志

Comparison of Different Incubation Conditions for Microbiological Environmental Monitoring（https://journal.pda.org/content/68/5/394）

We found the highest recovery of total aerobic count from areas with personnel flow using a general microbiological growth medium incubated at 30–35 °C. The highest recovery of moulds was obtained with mycological medium incubated at 20–25 °C. Single-plate strategies (two-temperature incubation or an intermediate incubation temperature of 25–30 °C) also yielded reasonable recovery of total aerobic count and moulds. However, recovery of moulds was found to be highly inefficient at 30–35 °C compared to lower incubation temperatures. This deficiency could not be rectified by subsequent incubation at 20–25 °C. 

【翻译】我们发现，使用在30–35°C下培养的普通微生物生长培养基，人员流动区域的总需氧菌计数恢复率最高。霉菌的回收率最高的是在20–25°C下培养的真菌学培养基。单板策略（双温培养或25-30°C的中间培养温度）也能合理回收总需氧菌数和霉菌。然而，与较低的培养温度相比，在30–35°C下，霉菌的回收效率非常低。这种缺陷无法通过随后在20-25°C下培养来纠正。

以上ISO14698-1：2003 没有给出明确的培养条件，BS EN 17141：2020给出温度范围为20-35℃，并且给出了适合细菌和真菌的培养条件但未明确培养条件的先后次序。PDA TR13是结合了各国法规及行业标准给出的大多数公司的一种做法，即先低温培养后高温培养，培养的时间给出了一般原则。PDA药物科学与技术杂志《微生物环境监测不同培养条件的比较》中研究先高温培养再低温培养不利于霉菌的生长。

综合以上法规和行业标准要求，我们如何选择培养条件呢？以下根据产品销往或准备销往的国家提供几个选择的维度，仅供参考，也希望各种行业标准后期能够趋于统一要求，至少不是相互矛盾的：