你需要知道的生物指示剂的管理

2023-05-10 13:58:59

大多数药企都会涉及到灭菌工艺，即使没有无菌产品，也会涉及到微生物实验用品的灭菌。那就必然会涉及到生物指示剂，在生物指示剂的选择、使用以及日常管理中我们应该注意哪些问题呢？下面我们就商业化生物指示剂一系列的管理来给大家做个梳理。

01

相关定义

生物指示剂  是一种对特定灭菌程序有确定及稳定耐受性的特殊活微生物制成品， 可用于灭菌设备的性能确认，特定物品的灭菌工艺研发、建立、验证，生产过程灭菌效果的监控，也可用于隔离系统和无菌洁净室除菌效果的验证评估等。
D值  将试验微生物杀灭90%所需的灭菌时间或灭菌剂量。

02

生物指示剂的分类


按照《中国药典》2020年版四部9207 灭菌用生物指示剂指导原则，可将生物指示剂分为以下三类（与EP 5.1.2、USP 1229.5规定一致）：

载体型生物指示剂：该类生物指示剂是由微生物芽孢和载体经包装而成，载体可以是碟形或条状的滤纸、玻璃、塑料或其他材料。

芽孢悬液生物指示剂：该类生物指示剂是将芽孢混悬于液体中。若用于液体物品灭菌，必须测定生物指示剂在灭菌液体物品中的芽孢数和D值。

自含式生物指示剂：该类生物指示剂是由芽孢和能够恢复微生物生长的培养基组成的系统，其耐受性是针对整个系统而言。

但EP5.1.2中还有一类，叫“Custom-made biological indicators”，也就是定制生物指示剂，顾名思义就是根据产品或项目特点定制的指示剂，通常不具商业购买价值，也不在咱们讨论范围内。

03

生物指示剂的选择


1、测试微生物种类的选择，可以根据灭菌方式选择使用什么指示剂种类，总结如下表：

灭菌方式 指示剂种类
湿热灭菌 嗜热脂肪地芽孢杆菌（过度杀灭法）——ChP、EP、USP
生孢梭菌（热不稳定性物品）——ChP
枯草芽孢杆菌（热不稳定性物品）——ChP
凝结芽孢杆菌（热不稳定性物品）——ChP
干热灭菌 萎缩芽孢杆菌——ChP、EP、USP
环氧乙烷灭菌 萎缩芽孢杆菌——ChP、EP、USP
过氧化氢灭菌 嗜热脂肪地芽孢杆菌——ChP、EP、USP

《中国药典》2020年版在湿热灭菌法中，除了嗜热脂肪地芽孢杆菌外还收载了用于热不稳定性物品灭菌的其他三种生物指示剂，那什么叫热不稳定性物品的灭菌程序呢？在中国GMP无菌附录第六十一条中描述最终灭菌为“无菌药品应当尽可能采用加热方式进行最终灭菌，最终灭菌产品中的微生物存活概率（即无菌保证水平，SAL）不得高于10-6。采用湿热灭菌方法进行最终灭菌的，通常标准灭菌时间F0值应当大于8，流通蒸汽处理不属于最终灭菌。”，最终灭菌通常要求F0大于8，当F0大于12时属于过度灭菌，其他不适合过度灭菌的就采用F0大于8这种情况。比如有些培养基会明确规定115℃灭菌30min。

2、芽孢总数

同样在中国GMP无菌附录第六十一条中描述“最终灭菌产品中的微生物存活概率（即无菌保证水平，SAL）不得高于10-6。”，灭菌程序确认采用的生物指示剂芽孢总数通常应不低于106。关于生物指示剂浓度的具体确定可以结合PDA TR1 Validation of Moist Heat Sterilization Processes：Cycle Design , Development ,Qualification and Ongoing Control进行。

3、D值

根据灭菌方式选择生物指示剂的D值，可以参考ISO 11138：2017系列灭菌标准来选择D值，总结如下：
干热灭菌用萎缩芽孢杆菌生物指示剂：在160℃时D值≥2.0min；
湿热灭菌用嗜热脂肪地芽孢杆菌生物指示剂：在121℃时D值≥1.5min；
环氧乙烷灭菌用萎缩芽孢杆菌生物指示剂：在54℃时D值≥2.5min；
只做国内项目时，也可以参考《中国药典》2020年版9207中列出的商品化生物指示剂的典型特征实例：

过氧化氢灭菌用嗜热脂肪地芽孢杆菌生物指示剂，目前还未见到有法规或指南对其D值进行明确的要求。
4、供应商的选择
在欧盟GMP附录1的8.43中，有要求“Suppliers should be qualified and transportation and storage conditions should be controlled in order that BI quality is not compromised”（供应商应具有资质，并应控制运输和储存条件，以免影响BI 质量）。因此我们选择供应商应注意收集并确认供应商的相关资质。



04

生物指示剂的验收


在接收到新购买的生物指示剂后，我们除了跟其他物料一样进行品名、数量、包装、供应商、有效期等基础信息核对外，还应在验收前按照前面所述各生物指示剂的D值要求对其进行评估，必要时进行D值测定（芽孢悬液生物指示剂）。实验室验收时应进行微生物纯度和形态的鉴定及测定微生物数量。微生物数量测定方法参照《中国药典》2020年版四部9208生物指示剂耐受性检查指导原则中的总芽孢计数，纯度和形态的鉴定可采用计数时培养结果进行菌落形态和细菌染色法来判断。如有必要则进行生物指示剂种属的鉴定（如在异常结果调查时）。

需要注意的是在湿热灭菌工艺中，生物指示剂的使用是通过生物学的方法来验证其灭菌效果，只要D值足够，即使初始微生物数量低于106，使用生物指示剂仍然可以验证其灭菌效果（可以结合PDA TR1 Validation of Moist Heat Sterilization Processes：Cycle Design , Development ,Qualification and Ongoing Control中Fbio相关内容确定D值与初始浓度的组合）。


05

生物指示剂的储存


生物指示剂应在标示条件或验证条件下进行储存、避光、远离毒性物质，防止过热和潮湿。一般芽孢悬液生物指示剂和自含式安瓿生物指示剂是需要2-8℃冷藏保存的，其他的是室温保存。



06

生物指示剂的使用


在有效期内使用 这个不难理解，超过效期保证不了品质。

按照预定用途使用 必须要强调一下，不同灭菌用途的生物指示剂不能够混用。比如虽然同是嗜热脂肪地芽孢杆菌的生物指示剂，有湿热灭菌用的，也有过氧化氢灭菌用的，绝对是不能混用的。

使用时须有阳性对照 即使用未经灭菌过程的生物指示剂同法培养，阳性对照生物指示剂应与参与灭菌测试的生物指示剂为同一批次。

按照说明书规定的温度和时间进行培养 生物指示剂在完成灭菌后需在4小时之内接种到相应培养基中进行培养。生物指示剂因为使用的菌种其不同培养方式也是不同的，一般要按照说明书规定的培养温度及时间进行培养（如果是国际化项目，建议按照ISO11138和USP 55的要求，至少培养7天）。自含式生物指示剂需要灭菌后挤压玻璃管释放培养基，且应在培养基冷却至室温后再进行挤压（不超过4h），以免影响测试结果或对人员造成危险。

生物指示剂应放在恰当的位置 比如湿热灭菌的冷点、灭菌气体不容易到达的地方等经灭菌验证评估出的薄弱点或者关键点。使用过氧化氢气相灭菌时，建议在每个点位放置多个生物指示剂以更充分的支持灭菌过程。在放置生物指示剂时应标明具体的位置、灭菌日期等关键信息。

不能对生产或者其他检测过程造成污染 使用生物指示剂时，应当采取严格管理措施，防止由此所致的微生物污染。



07

生物指示剂的销毁


发生以下情况时需要对生物指示剂进行销毁处理：

——使用过的生物指示剂（不论培养后是否长菌）

——过有效期的生物指示剂

——使用前检查包装不完整、破损的生物指示剂

在丢弃之前应按照生产商推荐的方式进行灭菌处理。一般可以是121℃、30min灭菌或焚烧。

作者：刘环宇

审核：魏巍、王孝东

下一步做点什么？
我想要再了解一下
更多信息