2020版《中国药典》通则0512 HPLC 告诉你如何优化色谱方法

发布日期:2020-07-06

近日,2020版《中国药典》发布并将于2020年12月30日生效。其中通则0512《高效液相色谱法》想必是实验室小伙伴们最关注的内容之一,但是对于里面描述的色谱柱内径、粒径、柱长、流速、梯度的调整,有没有懵圈的感觉?其实,这是随着超高效液相技术(小粒径色谱柱的应用)的发展,药典在适应新技术的使用,指导企业如何去优化方法,达到缩短分析时间、节省流动相的目的。今天,我们一起来分析在保持与现有方法相似的分离效果的前提下,如何选择合适的色谱柱和相应的色谱参数。


一、2020版药典与2015版药典0512参数调整对比 

表1:2020版药典与2015版药典0512参数调整对比

1594027607479412.jpg

(其余参数,如流动相比例、缓冲盐浓度、柱温、pH等改变,本文不涉及,此处不细说)

上表1中A/B/C三项,扩充了色谱柱的选择范围,而D/E/F则针对具体的每一个参数调整提供计算方式。下面,我们用具体的案例进行推导。


二、案例推导

1、改变柱长L和粒径dp

假设当前一个色谱方法为:

1594027708692963.jpg

目标:保持分离度R基本不变,缩短分析时间和流动相。


过程:根据公式1:

3.jpg


其中,k为保留因子,α为选择因子。当色谱柱固定相、流动相的组成及比例、柱温不变,则α和k不变。因此,分离度R仅与理论塔板数N相关。而N∝L/dp(正比),只要保持L/dp基本不变,则R基本不变。


当前色谱柱Column1的L1/dp1=250/5=50,所以需要从当前市场上常用的色谱柱中选择L/dp≈50的色谱柱,例如柱长为100mm,粒径dp为1.8μm的色谱柱,则L2/dp2=100/1.8=56,与当前色谱柱Column1的L1/dp1基本一致(比Column1的L1/dp1值50变化+12%,在药典规定的-25%~+50%范围内。有一定程度的增加,但有利于分离度R)。

注:此处粒径1.8μm是全多孔填料,产生的柱压比较高,因此,可选择表面多孔填料,例如2.7μm粒径的表面多孔填料色谱柱,因为其特殊的填料技术,实际的硅胶粒径仍只有约1.8μm(如下图1)。

图1:全多孔填料和表面多孔填料示意图(图片来源于网络)

4.jpg

图(a)为全多孔填料,粒径为5μm;

图(b)为表面多孔填料,规格为2.7μm,但实际的硅胶粒径约为1.8μm。

因此,选定的新色谱柱为:

1594028075359614.jpg

那么,采用色谱柱Column2时,保留时间会是多少呢?

根据公式2:

6.jpg

其中:公式3:

7.jpg


转化为公式4:

8.jpg

相较于Column1,采用Column2时,只调整了柱长L和粒径dp,而内径dc和体积流速F都未变,所以t仅与L成正比,即此时的保留时间t2=t1×L2/L1=0.4t1=4min,即只有初始保留时间的40%,极大地缩短了分析时间。


2、进一步调整内径和流速

通过上述第一步,调整柱长L和粒径dp,虽然保留时间t下降至初始的40%,也在一定程度上节省了流动相,但是因为体积流速F未改变,仍为1mL/min,还有进一步的下调空间。


此时,在色谱柱2的基础上,为了让保留时间t2保持不变,那么根据公式2,柱长L2不变,那么其线速度u2也不能变。根据公式3, u2不能变,那么如果想降低体积流速F,则色谱柱内径dc也需要降低。


根据市场上色谱柱的规格,比如我们选择内径为3.0mm的一根色谱柱,即:

1594028368441526.jpg

此时的体积流速F3需要调整为多少呢?

根据公式3,因为u不变,所以体积流速F∝dc2(正比),即:F3=F2×dc32/dc22=1×3.0×3.0/4.6/4.6=0.43mL/min

注:此处未采用药典公式F2=F1×[(dc22×dp1)/(dc12×dp2)] 计算,是因为当再考虑粒径倍数时,流速较大,导致系统压力较高,可能需要能够耐超高压的液相色谱仪。


所以,在保持分离效果和保留时间不变的情况下,体积流速下降,进一步节省了流动相。不过,细心的小伙伴可能已经发现了,对于等度洗脱,F3=0.43mL/min已经超出了药典规定的±50%的范围。所以,我们还可以再适当提高流速。 


3、进一步调整流速

应用范德姆特方程和参考文献(如下图,来源于网络),对于1.8μm粒径的色谱柱,若流速从0.43mL/min适当提高(例如提高一倍至0.86mL/min),其塔板高度H变化较小,根据H=L/N,则理论塔板数N也基本不变,再根据公式1,分离度R也基本不变(从下图看,即便H可能有较小程度的下降,N会升高,对分离度R是有利的)。

1594028619480119.jpg

即仍采用色谱柱Column3,但提高流速:

1594028648141200.jpg

根据公式3,u∝F,所以u4=2u3;再根据公式2,保留时间t与u成反比,所以t4=0.5t3=0.2t1=2min。

对比最终的色谱柱和参数如下:

1594028716986895.jpg

在保持分离度R基本不变的情况下,通过改变色谱柱规格,保留时间缩短了80%(从10min缩短至2min),流动相消耗量也节约83%。 


4、梯度洗脱如何调整

假设现有梯度洗脱程序如下:

13.jpg

根据梯度坡度公式5:    

14.jpg

其中:S为常数,Vm为柱体积,△ø为有机相变化,tG为梯度时间,F为体积流速。

为了让梯度坡度b保持不变(分离效果不变),在流动相比例不变的情况下,tG应与Vm/F成正比变化,即tG∝Vm/F=L×π×dc2/F,所以,tG2=tG1×(F1/F2) ×[(L2×dc22)/(L1×dc12)]。

所以,从Column1变为Column3时:

15.jpg

tG2=tG1×(1/0.86)×[(100×3.0×3.0)/(250×4.6×4.6)]=0.2tG1,即梯度程序变为:

16.jpg


运行时间从30min减少为6min,流动相体积从30×1.0=30mL减少为6×0.86=5.16mL。


三、总结

根据上述推导,通过在药典允许范围内调整色谱柱柱长、内径、粒径、流速,极大地缩短了分析时间,节省了流动相使用体积,一箭双雕。  


PS:

1. 以上仅为理论计算,实际的保留时间会根据系统体积不同而有所不同。

2. 对分析方法做了修改后,若超出药典规定范围,则需重新进行方法验证;未超出规定范围,则进行方法确认。

3. 公式较多,小伙伴们都推导明白了吗?欢迎大家收藏,反复推敲。